张玉双, 于富洋, 吴忠冰, 王一然, 李晶. 食管鳞癌原位模子 小鼠肠道菌群剖析 . 中国全科医学[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501
ZHANGYushuang, YUFuyang, WUZhongbing, WANGYiran, LIJing. Analysis of Gut Flora in a Mouse Model of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in Situ. Chinese General Practice[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501
最新的《全球癌症统计陈诉》数据显示，2020年全球食管癌新发病例数为60.4万例，殒命 病例数为54.4万例，划分占全球癌症新发、殒命 总病例数的3.1%、5.5%[1]。食管癌发病风险地域差异较大，我国是食管癌发病高风险国家，据统计2020年我国新发食管癌病例数为32.4万例，殒命 病例数为30.1万例，划分占全球食管癌新发、殒命 总病例数的53.7%、55.3%[2]。我国食管癌患者病理类型以鳞癌为主，早期行根治术后预后较好，但由于相当多的食管癌患者确诊时已处于中晚期，失去了手术时机，因此提高食管癌早期诊断率仍具有十分主要 的意义。
随着高通量测序手艺 的应用与生长，肠道微生态研究已成为现在 肿瘤领域研究的热门 之一。有研究证实肠道菌群在肿瘤的发生、生长中具有主要 作用，食管鳞癌患者口腔、癌组织及癌旁正常组织中菌群结构发生了改变并与食管癌的发生有关[3,4]。因肠道菌群的影响因素较多，本研究特选取饲养情形 可控的食管鳞癌原位模子 小鼠，以视察与食管鳞癌相关的肠道菌群结构转变 、筛选出特异性改变的肠道菌属，为食管鳞癌的早期筛查提供参考。
1 质料与要领1.1 实验动物从北京维通利华实验动物手艺 有限公司购置雌性SPF级C57BL/6小鼠20只〔及格证号：SCXK（京）2016-0006〕，体质量14~17 g，鼠龄6周。顺应 性喂养1周后将所有小鼠随机分为对照组（DZ组）和模子 组（MX组），每组10只。所有实验操作严酷 遵照河北医科大学实验动物中央 指南执行，遵守动物掩护、动物伦理原则及相关划定。本实验时间为2020年8月至2021年5月。
1.2 干预要领DZ组小鼠通例喂养32周，全程给予通俗 饮用水；MX组小鼠凭证 造模要领通例喂养并给予含0.1 mg/ml的诱癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）饮用水喂养16周，之后给予通俗 饮用水喂养至32周。4NQO饮用水制备要领：将诱癌剂4NQO（购自Sigma-Aldrich公司，型号：N8141）消融 于1，2丙二醇，配制成浓度为2%的母液并生涯 于-20 ℃冰箱，使用时凭证 0.1 mg/ml浓度比例混入饮用水中。
1.3 粪便的无菌网络 与处置赏罚喂养32周后网络 两组小鼠粪便：在笼具内里 放入清洁 的滤纸后将小鼠依次放入，每笼1只；用镊子轻轻刺激小鼠下腹和肛门，待小鼠排便后连忙 用冻存管举行 网络 ；将冻存管做好标志后放入液氮中，5 min后再将冻存管放入-80 ℃冰箱中生涯 。最终共网络 到20个粪便标本，每组10个。上述操作均在灭菌超净台上举行 ，且所用质料均接纳紫外线灭菌处置赏罚 。
1.4 粪便样本检测与数据剖析接纳十六烷基三甲基溴化铵（CTAB法）提取粪便标本基因组DNA，应用16SV34区域引物序列341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT举行 聚合酶链式反映（PCR）扩增；将PCR产物举行 磁珠纯化，并凭证 PCR产物浓度举行 等量混样，充实混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳，然后接纳胶接纳试剂盒接纳目的条带以纯化产物；最后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample PreParation Kit建库试剂盒举行 文库构建，经Qubit、Q-PCR定量检测构建文库及格后使用NovaSeq6000举行 上机测序。
通过对测序序列（Reads）举行 拼接、质控和过滤，以97%的一致性将序列聚类成为基于序列间相似度的分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），然后参照Silva138数据库对获得的OTU序枚举 行 物种注释，并凭证 物种注释情形 进一步剖析 Alpha多样性、Beta多样性、物种品貌。
Alpha多样性剖析 包罗：（1）稀释曲线：是形貌 样本多样性的曲线，能够直接反映样内情 关测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的富厚水平。（2）Shannon指数：为菌群物种Alpha多样性剖析 常用的指数，反映差异样本间物种多样性和均一性的差异，Shannon指数越大说明菌群多样性越高。
Beta多样性剖析 ：是对两组样品间的菌群组成情形 举行 较量 剖析 。主坐标剖析 （PCoA）是常用的Beta多样性剖析 要领，其基于Unweighted Unifrac距离来举行 剖析 ，样本间距离越远代表样本间多样性差异越大。
物种品貌剖析 接纳T-test磨练 和LEfSe剖析 ，其中LEfSe剖析 是一种软件剖析 ，其能够找到组间有统计学差异的生物标志物。
1.5 食管组织苏木素-伊红（HE）染色完成粪便网络 后正法两组小鼠，剥取其食管组织并接纳4%多聚甲醛溶液牢靠 ，之后举行 石蜡包埋、切片、HE染色，视察两组小鼠食管组织病理改变。
1.6 统计学要领接纳SPSS 21.0统计学软件举行 数据剖析 。切合正态漫衍的计量资料以（x±s）体现，先举行 方差齐性剖析 ，之后举行 T-test磨练 。Anosim相似性剖析 用于磨练 组间差异是否大于组内，判断实验分组是否存在意义。基于两两样本间的距离值排序获得的秩（组间的为Between，组内的为Within），这样任一两两样本的较量 可以获得3个分类的数据，并举行 箱线图的展示（若两个箱的凹槽互不重叠，则批注 两样本的中位数有显著差异）。以P0.05为差异有统计学意义。
2 效果 2.1 食管组织病理改变两组小鼠在实验历程中未泛起殒命 ，MX组小鼠均造模乐成。DZ组小鼠食管组织正常，MX组小鼠食管组织可见鳞状上皮增殖、癌巢形成且癌巢内可见角化珠（图1）。
Figure 1
Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice
2.2 肠道菌群测序数据质量评估与OTU剖析对两组小鼠共20例粪便标本举行 16Sr DNA基因测序，对检测的原始数据举行 拼接、过滤，获得有用 数据，平均每样品测得86 110条tags，经由 质控平均获得83 261条有用 数据，质控有用 数据量达54 489，质控有用 率达63.16%。然后基于有用 数据举行 剖析 共获得2 314个OTU，再用OTU序枚举 行 物种注释。效果 共有862个OTU注释到物种属水平。
基于OTU的Venn图中，2种差异颜色的圆对应两组小鼠粪便所含的菌群，重叠部门则为两组配合含有的菌群，DZ组较MX组肠道菌群物种富厚水平显着 增添 ，两组小鼠的肠道菌群结构存在差异，见图2。同时选择DZ组与MX组在门水平上品貌排名前10的物种，绘制物种相对品貌柱状图（图3），由图可见，在门水平上两组小鼠样本部门物种品貌存在显着 差异，MX组与DZ组相比，拟杆菌门（Bacteroidota）及厚壁菌门（Firmicutes）比例升高，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）及变形菌门（Proteobacteria）比例降低。
Figure 2
Figure 2 Venn diagram of intestinal flora between two groups of mice
Figure 3
Figure 3 Relative abundance of species at phylum level intestinal flora of mice between two groups
2.3 两组小鼠肠道菌群Alpha多样性剖析 2.3.1 两组小鼠肠道菌群物种多样性曲线两组小鼠菌群稀释曲线均趋于平展 ，则说明现在 样本测序数据量渐进合理，纵然增添 数据量也只会发生少量新的物种，见图4。
Figure 4
Figure 4 Rarefaction curve of intestinal flora between two groups of mice
2.3.2 两组小鼠肠道菌群Alpha多样性指数组间差异剖析MX组肠道菌群Shannon指数低于DZ组，差异有统计学意义（P0.05），见表1。
Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice
2.4 两组小鼠肠道菌群Beta多样性指数组间差异剖析PCoA图显示，MX组与DZ组样本基本上划分群集 在差异的象限，相距较远，样本间多样性差异较大（t=22.444，P=0.004），见图5。
Figure 5
Figure 5 PCoA diagram of Beta diversity in intestinal flora between two groups of mice
2.5 两组小鼠肠道菌群组间差异物种剖析 2.5.1 两组小鼠肠道菌群组间与组内差异性剖析Anosim相似性剖析 效果 显示，两组小鼠肠道菌群差异组间大于组内，差异有统计学意义（R=0.476，P=0.001），见图6。
Figure 6
Figure 6 Analysis of similarities （ANOSIM） of intestinal flora between two groups of mice
2.5.2 肠道菌群差异物种剖析在门水平，MX组未明确细菌（Unidentified_ Bacteria）、蓝细菌（Cyanobacteria）、易感微生物（Elusimicrobia）、弯曲杆菌（Campilobacterota）品貌高于DZ组，差异有统计学意义（P均0.05），见图7。
Figure 7
Figure 7 Differential species analysis of intestinal flora at the phylum level between two groups of mice
在属水平，共有27类菌的品貌在两组小鼠肠道菌群内有差异（P均0.05）。品貌较高的前10位肠道菌群：MX组普雷沃菌科_UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、拟杆菌属（Bacteroides）、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、普雷沃菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃菌属（Prevotella）、大肠埃希菌（Colidextribacter）、毛螺菌科_UCG-006（Lachnospiraceae_UCG-006）品貌高于DZ组，罗姆布茨菌（Romboutsia）、土杆菌属（Turicibacter）品貌低于DZ组，差异有统计学意义（P0.05），见图8。
Figure 8
Figure 8 Differential species analysis of intestinal flora at the genus level between two groups of mice
2.5.3 两组小鼠肠道菌群LEfSe剖析LEfSe剖析 效果 显示，两组共有21种肠道菌群品貌有差异，其中梭状芽孢杆菌纲（Clostridia）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、毛螺菌目（Lachnospirales）、Prevotellaceae_UCG-003、肠杆菌目（Enterobacterales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）、大肠埃希菌种（Escherichia_coli）、颤螺旋菌目（Oscillospirales）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）品貌在MX组升高，另外Peptostreptococcales_Tissierellales、Romboutsia_ilealis、Romboutsia、消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）品貌在DZ组升高（P0.05）。在属水平上，Prevotellaceae_UCG-003、Escherichia-Shigella、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX组品貌增高；Romboutsia品貌在DZ组增高（P0.05），见图9。
Figure 9
Figure 9 Histogram of LEfSe analysis of intestinal flora between two groups of mice
3 讨论
肠道是一个重大 的微生态系统，其拥有一个麋集 而多样的微生物群落，称之为肠道菌群，该菌群与宿主配合进化以建设相互关系[5]。肠道菌群对宿主康健的主要作用体现在剖析不行消化的碳水化合物[6]、合成维生素[7]、调治宿主防御[8]及调控肿瘤[9]，尤其在肿瘤生长历程中施展 了主要 作用。已有研究批注 肠道菌群与多种肿瘤的发生、生长和治疗效果亲近 相关，如结直肠癌[10,11]、肺癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]、玄色素瘤[15,16]等。现在 有关肠道菌群在结直肠癌方面的研究较多，已发现部门特异性差异菌群，并举行 了深入的机制研究，如研究发现Colidextribacter通过增添 癌基因bcl-2和bcl-xl的表达，抑制结肠细胞凋亡，从而促进肿瘤的形成[17]。产肠毒素懦弱 拟杆菌可发生懦弱 拟杆菌毒素，与结肠上皮细胞相互作用，激活调治性T淋巴细胞并降低白介素（IL）-2水平，随着IL-2水平的下降，辅助性T淋巴细胞（Th17）的发生导致IL-17水平升高，促进癌细胞存活和增殖[18]。双歧杆菌能增强树突状细胞功效，导致肿瘤微情形 中CD8+ T细胞的启动和群集 介导效应，从而增添 法式性殒命 受体-配体1（PD-L1）特异性抗体治疗效果，抑制结肠癌的生长[19]。
关于肠道菌群和食管鳞癌相关性的研究较少，现在 文献已报道的差异菌群多为从口腔取材，肠道菌群报道较少。位俊敏等[20]研究发现食管癌患者口腔中卟啉菌属表达升高。ZHAO等[4]报道食管癌患者唾液菌群中显著增添 的菌群为Firmicutes、革兰阴性菌门（Negativicutes）、硒单胞菌门（Selenomonadales）、Prevotellaceae、Prevotella和韦荣菌科（Veillonellaceae），而Proteobacteria、β-变形杆菌门（Betaproteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）和奈瑟菌属（Neisseria）则显著镌汰 。而DENG等[21]研究发现在属水平上，食管鳞癌患者粪便中链球菌（Streptococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、Subdoligranulum、布劳特菌属（Blautia）、Romboutsia、柯林斯菌属（Collinsella）、Paeniclostridium、多尔菌属（Dorea）和阿托波菌属（Atopobium）品貌显著增添 ，而毛螺菌属（Lachnospira）、Bacteroides、Agathobacter、Lachnoclostridium、副拟杆菌属（Parabacteroides）、帕拉普菌属（Paraprevotella）等菌属品貌降低。可见上述研究报道的菌群存在很大差异，纵观之前文献报道的虽为统一 类型肿瘤患者，但肠道菌群中检测出的具有统计学意义的菌群差异也较大，思量 肠道菌群是一个重大 的微情形 ，容易受到患者饮食、情志、基础疾病及药物等的影响，故本研究选取4NQO原位诱导食管癌模子 小鼠粪便为检测标本，最大限度使饮食、情形 等外界因素到达统一性，只管 阻止 误差。
本研究效果 显示，MX组与DZ组相比肠道菌群的物种富厚度和多样性显着 降低。两组肠道菌群差异物种剖析 显示，MX组小鼠粪便中Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus、Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Colidextribacter、Lachnospiraceae_UCG-006品貌高于DZ组，Romboutsia、Turicibacter品貌低于DZ组。LEfSe剖析 效果 显示，在属水平上，Prevotellaceae_UCG-003、埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX组品貌显着 增高，Romboutsia品貌在DZ组显着 降低。两种磨练 剖析 中均有统计学差异的菌属为Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Romboutsia，这4种菌属可能更具有生物标志物意义。Bacteroidota是肠道菌群的主要因素 ，其与Firmicutes约占肠道菌群的90%以上，研究证实拟杆菌属（Bacteroidetes）在结直肠癌患者粪便菌群中品貌显着 增高[22,23]，并有研究发现拟杆菌属在食管鳞癌诊断中准确率较高[21]；Prevotellaceae在食管癌患者口腔菌群中及结直肠癌患者粪便菌群中品貌虽有显着 增高[4,24]，但本研究效果 与其一致。但Lachnospiraceae_NK4A136_group及Romboutsia在结直肠癌及胃癌等肿瘤患者中品貌虽有显着 转变 [21,25,26]，但本研究效果 与之差异，因此还需进一步研究检测确定。
综上所述，食管鳞癌原位模子 小鼠肠道菌群物种多样性降低，存在特异性差异菌属，可为食管癌的诊断提供参考。虽然本研究发现了MX组较DZ组小鼠肠道菌群显著改变，但16SrDNA为半定量检测，故仍需宏基因组学或靶向微生物学的研究进一步明确差异菌群，并举行 越发深入的机制研究来举行 验证，寻找食管鳞癌特异性的靶菌群。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略