对于网友都想知道的如何制造简单且可重复的缺氧？和这样的dre凡士林身体乳多少题，本文有详细的解，希望能帮助到大家。
根据环境中可用的氧气，植物生长环境可以是常氧、缺氧或缺氧。当植物遭受涝灾、洪水或病原体攻击等胁迫时，就会发生缺氧/缺氧。植物能否在逆境条件下生存取决于其克服缺氧/缺氧条件造成的逆境的能力。稳定且可重复的缺氧环境对于研究植物耐缺氧机制有很大帮助。
尽管已经详细描述了植物水生实验，但它们通常很难进行并且产生不同的结果。目前，已报道了多种创造厌氧条件的方法，包括Hungate技术、VPI方法、手套箱室、玻璃干燥器和封闭式厌氧工作站。这些较旧的方法存在泄漏室、气罐成本高、需要定期维护、空间、用途单一、效率低和复杂等缺点。
该协议引入了一种简单而可靠的方法来确定缺氧。它简单、使用方便、性价比高、重复性好、不需要复杂的设备，可以在最小的空间内创造受控的厌氧环境，并且适合多种植物种类。相关研究发表在《Bio-protocol》上，标题为“GenerateReducingReducingAnoxiaConditionsforPlantPhenotyping”。
1.材料与试剂
实验室用品
1铝箔
2个厌氧气氛发生袋，OxoidTMAnaeroGenTM25L袋ThermoScientific，OXAN0025A
3AnaeroPackTM25L矩形容器ThermoScientific，R685025
4FalconTM15mL锥形管CorningTM，14-959-53A
5实验室瓶保护DURAN，PSC-47-11619
6厌氧系统/圆筒罐BDGasPakTM150系统，11-816
7个15mL微量离心管PierceTM，69715
8个带透明盖的培养皿FisherbrandTM，S33580A
9微孔手术胶带（可通过美国亚马逊购买）
10真空密封胶带Wevac，可通过美国亚马逊购买
11厌氧指示剂ThermoScientific，BR0055B
12凡士林
131/2MS介质配方参考
aMurashige和Skoog碱性盐混合MS培养基Sigma-Aldrich，M5524
b蔗糖Sigma-Aldrich，S1
西格玛奥德里奇琼脂，A1296
d2-乙磺酸MESSigma-Aldrich,M3671
e氢氧化钾KOHSigma-Aldrich,221473
1420V/V漂白剂配方参考商业漂白剂Clorox浓缩家用漂白剂，美国亚马逊有售
1580V/V丙酮配方参考Sigma-Aldrich,179124
植物材料
1拟南芥野生型
两个拟南芥突变体cax1-1-CS25435、cax1-2-SALK_021486、cax3-1-CS25429。
2.设备和软件
1VarianCary50生物紫外-可见分光光度计
2层流罩
3个移液器
4尼康D80数码单反相机
5植物生长室
6排塑料袋封口机
3、实验过程
A准备1/2MS培养基板和20%漂白剂。
B种子灭菌
1将每种基因型的100-200颗种子转移到单独的微量离心管中。
2将1mL的20mL漂白剂添加到离心管中。
3短暂搅拌以彻底混合种子。
4将种子浸泡在漂白剂溶液中15分钟，偶尔搅拌。
5短暂离心，让种子沉淀到管底。
以下步骤在无菌环境中进行。
6使用1mL移液器小心地除去漂白剂溶液。上清液中有一些种子漂浮是正常的。
7.向种子中加入1mL灭菌水，翻转3至4次。
8从管中取出无菌水并添加新的无菌水。
9重复步骤B7-85次以除去任何残留的漂白剂溶液。
10将1mL无菌水添加到种子中。在此阶段，种子可以立即储存或播种。种子可以在4C下保存一周，而不会失去发芽活力。
C播种
将11/2MS培养基板和灭菌种子置于室温下，并将种子接种在层流罩中。使用20L移液器吸出灭菌的种子，使它们单独排列在移液器尖端上。
2、将种子打入琼脂平板相应位置，保证种子间距均匀。每盘可接种50-60粒种子。
3.打开培养皿，放置2至3分钟，以干燥种子周围的水分。
4用医用胶带密封板，并置于植物生长室中，22C、12小时光照和20C、12小时黑暗，持续3周。
注根据植物种类，缺氧测定所需的植物大小/生长阶段可能有所不同。建议根据植物种类修改方案并测量植物生长不同阶段的缺氧以获得植物尺寸。例如，3周龄的拟南芥幼苗表现出表型。烟草和番茄的初步数据表明，幼苗的缺氧条件将在3周龄拟南芥所用的条件范围内。可能需要几天时间才会出现敏感性。
D缺氧实验
1圆筒罐用途
视频1使用“瓶子”治疗缺氧
a从培养皿上取下胶带。
b将板堆叠在厌氧系统/圆筒罐中。
c在瓶子边缘涂上一层薄薄的凡士林，并确保盒子密封。
d打开AnaeroGen25LGasPak袋并将其放入侧罐中。
e在GasPakTM和板之间放置2-3片纸巾，以散发GasPakTM产生的热量。
f拧紧瓶子，盖上铝箔，并在室温下避光孵育一段时间。
注根据植物种类，缺氧处理时间可能会有所不同。对于不同的植物，建议进行多个时期的缺氧测定以确定时期。对于拟南芥，在4、6、8和10小时进行分析。抗性和敏感菌株在8小表现出最明显的表型。
g可选在容器中添加厌氧指示剂，以确保低氧环境。
h缺氧处理后，将板重新连接并在维持在22C、12小时光照和20C、12小时夜间的植物生长室中孵育4-5天。表型清晰后，对板拍照。
使用2个矩形25LAnaeroPackTM系统
视频2使用“盒子”治疗缺氧
a从培养皿上取下胶带。
b将装有植物的培养皿分成两堆放在盒子内。
c在盒子边缘涂上一层薄薄的凡士林，并确保盒子密封。
d打开AnaeroGen25LGasPak袋子，将其放入矩形盒子内的小隔间中，并在GasPak和板之间放置2-3块纸巾，以散发GasPak产生的热量。
e用铝箔盖住瓶子，并在室温下避光孵育所需的时间。
f缺氧处理后，将植物置于标准生长条件下。4-5天后给盘子拍张照片。
3真空密封袋的使用真空密封袋用于除去少量极板中的氧气。
视频3使用“袋子”治疗缺氧
a从培养皿上取下胶带。
b用铝箔覆盖培养皿的两侧。
c将培养皿放在Wevac袋内折叠的组织层顶部。
d打开AnaeroGen25LGasPak袋子并将其放在袋子内的纸巾下面。
e立即用热塑料袋封口机密封袋子，并在室温下孵育所需的时间。
f缺氧处理后，将板置于标准生长条件下，并在4-5天后拍照。
E叶绿素估算
1.收集缺氧前后的样本组织各50mg，液氮研磨。
2添加1mL80丙酮并涡旋充分混合。
3室温孵育30分钟。
4以17,900g离心1分钟。
5将上清液转移至15mL离心管中。
6重复步骤E2-53次或直至颗粒变成无色。
780添加6mL丙酮。
8使用分光光度计测量混合上清液在645nm和663nm波长处的吸光度。
9使用Arnon方程计算样品中的总叶绿素[总叶绿素=202+802]。
10实验至少重复两次，并以平均值SE表示。
4.数据分析
缺氧实验的结果一式三份进行验证，每次测试13至15颗种子。对三个生物重复进行叶绿素估计实验，结果表示为平均值SE。
5.公式
11/2MS培养基
将以下组分溶解在800mL双蒸水中215gMS介质、5g蔗糖、500mgMES，并在搅拌下添加KOH将pH调节至56-58。使用双蒸水将体积定至1L。将8琼脂添加到2500mL瓶中。将培养基均匀地分配到每个装有琼脂的瓶子中。121C高压灭菌20分钟。培养基冷却后，将每瓶培养基倒入层流罩中的10个培养皿中。将培养皿放在层流罩中30分钟，让培养基凝固。培养基可在4C保存2-3周。将培养基恢复至室温并在使用前检查板是否受到污染。
220漂白剂
在50mL离心管中，混合10mL漂白剂和40mL高压灭菌的双蒸水。通过上下颠倒管子充分混合。漂白剂在室温下可保存2至3周。
3.80丙酮
混合40mL丙酮和10mL双蒸水。通过倒转或涡旋管子充分混合。该溶液可在室温下储存在阻燃区域。
6.原始信息
Mathew,IE、Rhein,HS、Green,AJ和Hirschi,KD2023GeneizingreproductiveanoxiaConditionsforplantphenotypingBioProtoc133:e4603DOI:1021769/BioProtoc4603点击链接查看原文。
七、参考资料
[1]Boyes,DC,Zayed,AM,Ascenzi,R,McCaskill,AJ,Hoffman,NE,Davis,KR和Gorlach,J2001基于生长阶段的拟南芥表型分析（一种用于高通量功能基因组学的模型植物细胞）植物137:1499-1510
[2]Bui,LT,Shukla,V,Giorgi,FM,Trivellini,A,Perata,P,Licausi,F和Giuntoli,B2