作者麻道君研究组
广州中医药大学第四临床医学院
骨关节炎是中老年人常见的慢性关节疾病，累及关节软骨、滑膜、软骨下骨等关节组织，主要表现为关节疼痛、僵硬、活动受限。骨关节炎的病因尚不清楚，年龄、性别、肥胖和遗传因素是增加患骨关节炎风险的因素。目前市场上尚无有效的OA治疗方法。
马杜军课题组通过对以往骨关节炎治疗文献的数据挖掘以及广东省著名东方医学家彭丽萍教授治疗膝骨关节炎的临床经验总结，发现牛膝最为常见。牛膝是一种常用于治疗骨关节炎的药物，具有“标本兼治”的独特功效。“通灵”效应让我们想象，牛筋草的“强化”作用应该包括抗退化和促进恢复功能。关节软骨的。牛膝的化学成分主要由多糖、皂苷、甾醇、黄酮类及多种微量元素组成，对关节疾病的主要药理作用是抗炎镇痛，促进软骨细胞增殖和骨髓干细胞生长。细胞死亡率和其他影响。在前期研究的基础上，马多君研究团队通过一系列分子生物学实验、组织工程实验、动物实验、临床实验的反复验证，在治疗骨关节炎方面取得了突破性进展。
牛膝辛、苦，性淡。入肝、肾、膀胱经。具有活血化瘀、利关节、行血下行、滋补肝肾的功效。
1.基于CRISPR/Cas9技术研究牛膝活性成分促进BMSCs软骨分化的网络机制
骨关节炎是以关节软骨损伤为核心病理改变的疾病，软骨组织的自然恢复缺乏正常的力学性能，由于没有理想的药物或治疗方法来恢复软骨，治疗困难。与其他来源的细胞相比，骨髓间充质干细胞能够更好地分化为软骨细胞。虽然中药干预下干细胞成软骨分化具有特点和优势，但促进软骨细胞分化的研究较少。初步研究表明牛膝药血清培养BMSCs可促进软骨细胞标志物Sox9、蛋白多糖和II型胶原的明显表达，提示BMSCs向软骨细胞分化，但作用机制尚不清楚。马杜军课题组体外培养兔BMSCs，将BMSCs和牛膝药血清与传统成软骨剂共同孵育，促进BMSCs体外诱导软骨形成。利用蛋白质组学iTRAQ技术和基因组高通量测序筛选牛膝诱导软骨分化的关键差异蛋白、基因和信号通路，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑特定靶点RAB39B基因来验证结果。揭示牛膝对骨髓间充质干细胞的体外作用及软骨细胞扩增和诱导分化的机制。证实了牛膝“补肝肾、强筋骨”的东方医学理论，为临床恢复关节软骨损伤、退化提供了理论依据。
图1CRISPR/Cas9的结构和作用机制
图2骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果
图3LentiCRISPRv2GFP载体信息图
图4RAB39B敲除慢病感染兔骨髓间充质干细胞100
图5使用CRISPR/Cas9系统qRT-PCR检测RAB39B敲除后骨髓间充质干细胞中COLII和COLmRNA的表达。
图6使用CRISPR/Cas9系统Westernblot检测RAB39B敲除后骨髓间充质干细胞软骨形成相关通路中RHOA、LIMK和Sox9蛋白表达变化。
图7骨关节炎治疗基因编辑途径的假设图。
2、牛膝活性成分联合BMSC-Exos对OA模型兔局部骨组织微结构及炎症复合物的影响。
观察牛膝乙醇提取药血清培养的骨髓间充质干细胞来源的外泌体对实验性兔骨关节炎模型关节局部骨组织超微结构和炎症小体的影响。方法将20只健康实验家兔按照随机数字表法分为空白组、模型组和牛膝乙醇提取物低、中、高剂量组，每组4只。对照组给予等量蒸馏水和牛膝乙醇提取物，给予乙醇。低、中、高剂量灌胃1周后，采血制备含牛膝醇提取物的药血清，采用骨髓间充质干细胞测定牛膝醇提取物的药血清浓度。方式，文化得以延续。第7天，提取骨髓间充质干细胞外泌体，从间充质干细胞上清中提取外泌体，然后通过关节穿刺注射到不同组的兔膝骨关节炎模型中，每周一次，连续3周。软骨组织病理学、关节活动度评分和关节粘连改善评分，采用microCT检测膝关节周围局部骨组织的微结构和骨量，并进行qRT-PCR。用于检测滑膜组织炎症小体关键分子NLRP3mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4mRNA、NF-kBmRNA的表达水平。结果实验兔膝关节注射外泌体六周后，低剂量、中剂量、高剂量组兔膝关节活动度和粘连改善评分较模型组显着提高，且正相关.按剂量。模型组兔膝关节软骨基质染色变浅，软骨细胞数量明显减少，关节表面凹凸不平，血管侵犯潮腺结构，发生在低、中、和高剂量组。兔膝关节软骨基质染色逐渐恢复正常，软骨细胞数量较模型组减少，但随着组数增加，软骨细胞变为椭圆形，关节面恢复正常到平稳，观察潮线结构，一一恢复正常。MicroCT检测结果显示，与模型组相比，低、中、高剂量组兔膝关节平均值、BMD、ConnDn、BV/TV均显着升高，BS均显着降低，而BS/BV显着增加，但似乎有所下降。BS/TV、TbN、TbSp、DA组间比较，无统计学差异，且Mean、BMD、ConnDn、BV/TV、BS与剂量相关。qRT-PCR检测结果显示，模型组兔滑膜组织中NLRP3mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4mRNA、NF-kBmRNA的相对表达量显着高于空白组。低、中、高剂量组滑膜组织mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4mRNA、NF-kBmRNA相对表达量均显着低于模型组，且呈正相关与剂量。结论牛膝乙醇提取物能够改善OA模型局部骨组织的骨含量和骨微结构，并增加炎症小体通路关键分子NLRP3mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4mRNA和NF-kB的表达。mRNA的作用机制尚不清楚。
图8外泌体提取及鉴定
图9microCT检测各组兔膝关节周围骨组织的显微结构图像。
图10各组兔膝关节滑膜组织中NLRP3mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4mRNA、NF-kBmRNA相对表达量比较
3、牛膝活性成分通过花生四烯酸途径降低骨关节炎的炎症反应。
牛膝是治疗骨关节炎OA的常用中药。活性成分之间的相容性现在是理解中医机制的一个突破。本研究旨在确定牛膝治疗OA的配伍性和可能的机制。结果如下OA组粘附评分高于NC组，且干预组有下调趋势。假手术组中OA组关节液中CHI3L1和IL-1较NC组显着升高。G、I和L组显示CHI3L1显着下调，而C、F、I、K和L组显示OA模型中IL-1关节粘附、软骨损伤和滑膜组织减少；J和L组显示恢复，G、I、L组显示滑膜组织恢复。因此，选择I组和L组进行代谢物分析，3-吲哚丙酸略有上调。I组和L组中辅酶醌A、前列腺素H2和1-羟基-3-甲氧基-10-甲基吖啶酮下调。功能分析表明花生四烯酸AA代谢途径得到富集。I组和L组中的PGE2和COX2等AA代谢途径得到了验证。总之，羟基蜕皮酮、齐墩果酸和牛膝多糖在003-g/mg、20-g/mg、200-g/mg或003浓度下具有相容性。-g/mg、20g/mg和100g/mg可能分别是牛膝的配伍性。
图例购买牛膝的三种成分并根据其m/z值进行鉴定。通过质谱法检测牛膝的单体成分。B-蜕皮甾酮的分子式为C30H48O3，m/z值为117（图1A）。齐墩果酸的分子式为C27H44O7，m/z值为2519（图1A）。1B）。
图11牛膝活性成子结构
图12三种牛膝单体的不同组合对治疗后关节粘连和炎症水平的影响。
图13牛膝3个单体I组和L组差异表达代谢物的层次聚类分析。
图例对差异表达代谢物进行富集分析，发现I组花生四烯酸AA代谢途径显着富集。BELISA检测大鼠血清。
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