菠萝是一种具有重要商业价值的热带水果作物。尽管菠萝果实发育过程中发生的生理变化已得到很好的表征，但人们对果实成熟过程中发生的分子事件知之甚少。了解菠萝果实成熟的分子基础将有助于通过分子育种或基因改造开发新品种。在这项研究中，我们开发了由9277个元件组成的菠萝微阵列，并用它来分析菠萝果实成熟过程中发生的基因表达变化。
从果实成熟的角度来看，肉质水果分为气候水果和非气候水果。在苹果和香蕉等更年期水果中，在成熟初期观察到乙烯生物合成的爆发和呼吸作用的增加。相比之下，菠萝等非绝经期水果缺乏自催化乙烯爆发和增加的呼吸作用。尽管菠萝果实发育过程中发生的生理变化众所周知，但对调节菠萝果实成熟的分子事件却知之甚少。
高通量测序和微阵列技术的出现促进了对许多物种果实发育过程中基因表达变化的大规模研究，包括绝经期水果番茄和苹果，以及非绝经期水果草莓。在之前的一项研究中，我们报道了涵盖菠萝果实绿色成熟和成熟阶段的消减和归一化ESTcDNA文库的构建。近日，短读长深度二代测序技术应用于成熟菠萝果实基因发现项目。
在这项研究中，我们报告了基于EST的菠萝微阵列的开发以及用于识别果实成熟过程中差异表达基因的方法。使用在线生物信息学工具，我们为在果实成熟过程中表现出差异表达的菠萝基因分配了假定的身份和功能。
菠萝果实成熟的微阵列分析可识别与重要代谢途径和过程相关的基因表达变化。
发现从不同菠萝组织中分离出的9277个cDNA在微阵列载玻片上重叠。使用来自成熟绿色果实和完全成熟果实的探针进行杂交。
总共进行了3次重复微阵列杂交，结果分析鉴定出271个差异表达的EST。其中，在菠萝果实成熟过程中，160个上调，77个下调。在271个EST序列中，184个与已知基因产物具有显着同源性，53个与未知功能产物具有同源性，34个与GenBank数据库中已知的任何植物基因序列具有显着同源性。我们对具有同源物的EST序列进行了功能分类分析，并指定了拟南芥同源物ID标签。
氧化还原活性
在成熟果实上调基因的FAC分析中，还原-氧化活性显示出最高的富集分数。DAVID热图分析确定了26个基因，表达范围为151至756，这些基因在功能上分为与氧化还原和氧化还原酶活性相关的常见GO术语。热图中识别的许多基因与歧化酶、过氧化还原蛋白、戊二醛、抗坏血酸-谷胱甘肽和硫氧还蛋白活性相关。
特定生物体的氧化状态受到参与应激反应的酶的影响。氧化状态会影响围绝经期果实成熟开始时乙烯的产生速率。果实成熟可以被认为是涉及一系列氧化还原酶的分解代谢过程，导致果实组织分解并释放乙烯作为分解代谢副产物，加速成熟。应研究更年期和非更年期水果物种之间氧化状态和分解代谢应激反应模式之间可能存在的差异。在菠萝中观察到的氧化还原活性也可能与果实的大尺寸和低氧张力有关。
有机酸代谢
FAC分析确定有机酸代谢是菠萝果实成熟过程中的一个重要生物过程。通过DAVID热图分析，识别出表达范围为150-852的18个基因，它们在功能上聚类为与有机酸代谢和其他相关过程相关的常见GO术语。
据报道，绝经期和非绝经期果实成熟期间有机酸含量增加。菠萝的酸度在生长过程中增加，并随着果实的成熟而开始减少。柠檬酸和苹果酸是影响大多数绝经期和非绝经期水果的酸味和酸味的两种主要有机酸，如桃子、苹果、猕猴桃、葡萄、橙子、樱桃、草莓和菠萝。此外，柠檬酸在菠萝发育过程中增加最多，在果实成熟前达到峰值，而苹果酸在发育过程中变化不大。
金属酶活性
FAC分析确定了对无机化合物、金属离子辅助因子和镉的反应是菠萝果实成熟过程中的重要生物过程。DAVID热图中总共鉴定出16个基因，表达量范围为151至409倍。
在热图分析中鉴定出许多响应无机物质、金属离子辅助因子和镉而激活的金属酶。这些包括超氧化物歧化酶、金属硫蛋白和光敏色素A同系物。已知金属酶可调节许多植物作物的氧化还原状态，并参与许多重要的生物过程，如氧化应激、金属离子稳态、致病性、金属介导的催化和细胞死亡。
菠萝废物已用于生物修复，以去除废水和污水处理厂中的有重金属。这可能是由于成熟水果中含有丰富的金属酶，如MET、SOD和PHYT。它在废水处理过程中充当配体，并具有螯合过量金属离子的能力。事实上，MET参与镉解和金属离子稳态。先前的研究表明，菠萝果实含有高水平的金属硫蛋白转录本，其中小转录本占主导地位。
糖酵解和糖分解代谢
通过FAC和DAVID热图分析鉴定了参与糖酵解和糖分解代谢的基因。KEGG通路可视化分析确定了糖酵解通路图中的6个基因，这些基因在成熟果实中上调了156至756倍。这些发现表明糖酵解和糖分解代谢在菠萝果实发育过程中的重要性。KEGG图谱中识别的大多数基因也在相应的热图矩阵中被识别。
有趣的是，非绝经期葡萄的基因表达谱还发现了参与糖酵解和葡萄糖分解代谢活动的显着上调基因簇。总而言之，葡萄和菠萝的结果证实了糖酵解在非绝经期成熟过程中的重要性。成熟的水果会增加ATP能量储备，并可通过增加糖酵解来减少容量，随后可被参与重要水果代谢过程的酶所利用。糖酵解相关基因的上调也可能与糖从韧皮部的释放和液泡中的储存有关。抗氧化活性和自由基代谢。
FAC分析表明，菠萝果实成熟过程中L-抗坏血酸生物合成基因、抗氧化活性和ROS代谢显着增强。DAVID热图分析表明，共有5个菠萝基因与维生素生物合成、多元醇代谢和肌肉相关的GO术语在功能上相关。-肌醇代谢和L-抗坏血酸生物合成聚集在一起。仅举几个例子，肌醇加氧酶4、肌醇加氧酶2和L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶的表达水平增加了155至256倍。
放射性示踪剂证据表明，葡萄GPP是参与非绝经期葡萄浆果的L-抗坏血酸生物合成的关键酶。我们的菠萝GPP表达谱还与果实成熟过程中桃子和番茄GPP直系同源物相关。菠萝MIOX4和MIOX2基因与葡萄和番茄中发现的MIOX直系同源基因相关，并参与L-抗坏血酸生物合成过程中肌醇向D-葡萄糖磷酸盐的转化。
蛋白质降解和泛素型管家过程
DAVIDFAC分析显示绿色和菠萝果实中蛋白质降解和泛素蛋白质分解代谢均被激活。两种FAC检测中蛋白质降解和泛素蛋白质分解代谢的富集分数相似，但显着低于其他上调的生物过程。DAVID热图分析确定了参与蛋白质降解和泛素蛋白质分解代谢的四个下调基因和三个上调基因。KEGG通路分析直观地生成泛素介导的蛋白质降解图谱，揭示在和绿色成熟菠萝果实中活跃的基因。
蛋白质分解对于植物发育的许多方面至关重要。它在细胞管理和应激反应中发挥作用，去除异常和错误折叠的蛋白质，提供制造新蛋白质所需的氨基酸，通过减少关键酶和调节蛋白的丰度来控制体内平衡，并控制某些植物器官的生长和发育。我是负责人。细胞基因功能和程序性细胞死亡。我们的生物信息学分析表明，菠萝果实发育过程中的蛋白质降解是一个涉及多种蛋白水解途径的复杂过程。受损蛋白质的选择性蛋白水解主要由泛素介导的过程控制，涉及泛素和几种泛素结合酶。
菠萝水果菠萝蛋白酶
DAVIDFAC对77个下调基因的分析表明，半胱氨酸型肽酶活性是绿色成熟果实中最重要的过程。这主要是由于Ac-17和Ac-31，DAVID热图中鉴定出的两种菠萝果实菠萝蛋白酶，并显示在菠萝从成熟的绿色果实到成熟的果实的成熟过程中强烈下调。菠萝蛋白酶是菠萝特有的半胱氨酸型蛋白酶。半胱氨酸型蛋白酶也存在于其他水果中，例如猕猴桃、木瓜和无花果。
对菠萝EST文库的分析发现了绿色成熟水果中的许多菠萝蛋白酶抑制剂和水果菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶抑制剂Ac124是绿色水果文库中最丰富的EST，已分离出52个克隆。Northern分析还证实，Ac122和Ac124的表达随着菠萝果实的发育而降低。Ac124菠萝蛋白酶抑制剂对应于菠萝中的双胱抑素菠萝蛋白酶抑制剂前体同系物，对菠萝果实菠萝蛋白酶没有抑制作用。Ac-122和Ac-3033在绿色成熟菠萝果实中可能更丰富，特别是由于它们在果实成熟前的植物防御机制中作为半胱氨酸型蛋白酶的作用。
通过实时RT-PCR验证微阵列数据
为了验证微阵列结果，进行定量实时PCR以确定从成熟绿色和成熟水果差异表达基因列表中随机选择的10个菠萝基因的表达水平。为了避免偏差，测试基因选自多种过程，包括氧化还原活性、有机酸代谢、金属酶活性、维生素C生物合成、抗氧化活性、半胱氨酸型肽酶活性和泛素蛋白水解。qRT-PCR表达结果与所测试的9个基因中的10个基因的微阵列表达数据相关。对MGS和G3PD-816mRNA水平的qRT-PCR测量显示，与成熟的绿色果实相比，成熟的果实中的表达分别增加了26倍和50倍。通过微阵列分析确定表达的优点。
在本研究中，我们使用包含9,277个EST元件的专用菠萝微阵列分析了菠萝果实成熟过程中表达水平的变化。我们鉴定了271个独特的菠萝克隆，从果实成熟的绿色阶段到成熟的阶段，它们的表达差异至少有15倍。
在这271个EST中，有237个与编码已知或未知功能的蛋白质的植物序列表现出显着的同源性。其中，160个EST在菠萝果实成熟过程中上调，77个EST下调。此外，定量实时PCR分析验证了从各种细胞过程中随机选择的10个基因中的9个的微阵列结果。
微阵列结果的生物信息学分析表明，氧化还原活性是菠萝果实成熟过程中的一个重要生物过程。在菠萝果实成熟过程中，柠檬酸、苹果酸等有机酸代谢和金属酶活性也上调。编码金属酶的基因的显着增加可能有助于菠萝废物的生物修复特性。
糖酵解相关基因在菠萝果实成熟过程中也显着上调，可能为关键的成熟过程或响应糖的流入和液泡内的储存产生ATP能量储备。此外，L-抗坏血酸生物合成、抗氧化活性和ROS代谢在菠萝果实发育过程中上调。L-抗坏血酸和谷胱甘肽的抗氧化特性可能参与菠萝果实成熟时H2O2的解。H2O2可能在菠萝果实发育过程中激活维生素C积累和上调抗氧化活性方面发挥生物学作用。
我们的研究还鉴定了两种菠萝蛋白酶，Ac-122和Ac-3033，它们在成熟的绿色菠萝组织中含量很高，可能参与果实成熟前抵抗病原体攻击的植物防御机制。
应用基于微阵列的方法研究果实发育过程中大规模基因表达变化将有助于我们了解菠萝果实成熟和非绝经期果实成熟的分子基础。菠萝微阵列的发展还将使得未来能够对不同菠萝发育过程、条件和处理中的基因表达变化进行大规模分析。
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